¿Cómo se determina la cantidad de cannabinoides en el cannabis?

Cómo hacer una cromatografía de capa fina

Probablemente, muchos de vosotros os preguntáis qué tipo de prueba se realiza para determinar si una variedad de marihuana tiene índices considerables de los principales cannabinoides, así como el método para saber el tanto por cierto (más o menos aproximado, como veremos) de éstos en la muestra testada. En este post os explicaremos paso a paso cómo hacer una cromatografía de capa fina (CCF, TLC en inglés), que nos dará los porcentajes aproximados de los principales cannabinoides detectados en cada muestra. Para ello, partimos de 8 muestras distintas de la variedad de marihuana Fruity Jack de Philosopher Seeds, con el simple objetivo, en este ejemplo, de saber cuáles de los 8 fenotipos analizados presentan cantidades altas del cannabinoide CBD.

El uso medicinal de la marihuana está ganando terreno a marchas forzadas los últimos años, así como el interés por parte de criadores y consumidores de saber las cantidades exactas de cannabinoides que contienen sus variedades de cannabis preferidas. Es por ello que expresiones como "cromatografía de capa fina" o "cromatografía de gases" nos son cada día más familiares. Para saber más sobre estos sistemas de análisis, nos reunimos con un buen amigo y colaborador que nos explicó paso a paso un sistema de cromatografía de capa fina con el que obtendremos resultados fiables de manera rápida y segura para nuestra salud.

Materiales necesarios

Para el proceso de análisis de las muestras necesitaremos los siguientes materiales:

• Placas para cromatografía de capa fina, que pueden ser de aluminio, vidrio o plástico, recubiertas siempre de un material sólido adsorbente (gel de sílice o alúmina)
• Disolvente, para este post se ha utilizado Hexano
• Micropipeta de laboratorio
• Agua destilada
• Reactivo, en este caso sales "Fast Blue B"
• Eluyente, para nuestro ejemplo Cloroformo
• Papel secante, tubos eppendorf, botes de cristal, bandeja, pipeta , lápiz de grafito

Preparación de la muestra

Antes de empezar, cabe remitir una vez más a cualquiera que quiera usar productos químicos a las medidas básicas de seguridad en trabajos de laboratorio. También, como siempre que se quiere hacer cualquier experimento, debe intentarse que éste se desarrolle en un ambiente lo más limpio y estéril posible, evitando contaminaciones que alteren o falseen los resultados del ensayo.

Para la preparación, se mezcla 1ml de disolvente (Hexano) para cada 0.1 gr de muestra en un tubo eppendorf. Se agita durante 20 segundos y deja disolver un mínimo de 3 minutos antes de proseguir. Durante todo el proceso, nuestro colaborador nos advierte de la importancia del correcto y cauteloso etiquetado de cada muestra pues, de lo contrario, en caso de querer hacer varios análisis, es fácil confundirse y mezclar resultados. Una vez la muestra está preparada, se recogen 0.2 microlitros con la micropipeta y se depositan en el punto que anteriormente hemos marcado con el lápiz en la placa, en la parte inferior de ésta. Para nuestros análisis, usaremos una placa por cada 4 fenotipos de Fruity Jack a testear, dos placas en total. Depositamos las 8 microgotas en las dos placas (4+4) y ya tenemos nuestras muestras preparadas para el siguiente paso.

Descarboxilación y análisis de las muestras

A continuación, procederemos a descarboxilar las muestras. Para ello, colocaremos las dos placas con las 8 microgotas en una bandeja de pyrex que meteremos en el horno a unos 120-140º durante 5-10 minutos aproximadamente. Seguidamente, prepararemos dos tarros de vidrio (uno para cada placa) con 2ml de cloroformo cada uno. Con sumo cuidado colocaremos las placas dentro de los botes, de manera que sólo la parte inferior de las placas, donde están las microgotas, queda en contacto con el eluyente. Es importante observar cómo éste va subiendo por la placa; en caso de no hacerlo de manera uniforme, probablemente deberemos descartar los resultados de ésta; esto suele suceder cuando usamos placas viejas o en mal estado. Al subir el cloroformo, va dejando un rastro en forma de manchas (de momento no visibles) para cada uno de los principales cannabinoides, manchas que más tarde nos dirán los porcentajes aproximados de cada uno.

Dejaremos que el eluyente recorra por completo la placa hasta llegar a la parte superior (unos 30 minutos). Las retiraremos cuidadosamente y las dejaremos unos 5 minutos sobre el papel secante en posición vertical, con las marcas a lápiz en la parte inferior. Mientras, prepararemos la mezcla con el reactivo para hacer visibles las manchas. Para realizar este proceso contamos con distintos métodos, desde luz ultravioleta a reveladores o reactivos específicos para desarrollar coloración en las manchas. Nosotros hemos escogido la opción más conocida: vertemos 20ml de agua destilada en una bandeja de plástico y añadimos 0.1 gr de un reactivo - sales - llamado Fast Blue B (C₁₄H₁₂N₄O₂Cl₂ · ZnCl_{2) .} Agitamos bien la mezcla para que quede uniforme y todas las sales se disuelvan completamente en el agua destilada.

Ya sólo queda sumergir cada placa en la bandeja durante apenas dos segundos (podríamos también rociarlas con la mezcla, pero es mucho más seguro para la salud sumergirlas, aunque desperdiciemos algo de líquido), para retirarla a continuación y dejarla sobre el papel secante de nuevo, siempre en posición vertical y con las marcas abajo.  Pasados pocos segundos, aparecerán unas manchas a lo largo de las placas, manchas que muestran la presencia o no de determinados cannabinoides (THC, CBD, CBN, CBG, THCV, CBC), así como su contenido aproximado. Cada cannabinoide tiene su color y posición en la placa, así que resulta sencillo saber si un cannabinoide concreto se halla presente o no en la muestra. Su contenido se determina midiendo el diámetro de la mancha y comparándola con una tabla de conversión que nos dará su contenido aproximado en %. Nosotros utilizamos la que viene incluida en el kit de análisis de cannabinoides de Alpha-Cat .

Conclusiones de la cromatografía de capa fina

Pese a carecer de la precisión de la cromatografía de gases, éste parece un buen sistema para una determinación aproximada del índice de cannabinoides presentes en una muestra, así como de su presencia o ausencia. En nuestro caso, por ejemplo, nos ha sido de gran utilidad, pues lo único que queríamos era saber si las 8 muestras analizadas contenían índices de CBD altos . De los 8 fenotipos analizados, 6 de ellos han dado contenidos de CBD más que notables, para felicidad de muchos usuarios medicinales de marihuana. El sistema resulta especialmente útil en procesos de selección y crianza, pues nos permite saber qué individuos nos interesan más sin la necesidad de costosos análisis de cromatografía de gases.

Con este método cualquiera puede hacer sus propios análisis en casa y saber qué fenotipos de los que cultiva tienen, por ejemplo, CBD, o cuál de ellos tiene mayor concentración de THC.  Cuanto más se piensa, más aplicaciones parece tener este tipo de análisis, especialmente para selección de individuos en relación a su contenido específico en cannabinoides. Pueden también ensayarse distintos tiempos de floración para saber el momento óptimo de cosechar las plantas de marihuana, fertilizantes, sustratos, etc. en clones y ver qué contenidos se obtienen en cada muestra, buscar un fenotipo que nos de un equilibrio determinado entre sus distintos cannabinoides, etc.

Las posibilidades, como decimos, parecen abundantes, aunque cabe tener en cuenta siempre que los resultados obtenidos no tienen la precisión de la cromatografía de gases, aunque pueden servirnos para saber qué fenotipos concretos nos interesa estudiar más en profundidad. Os deseamos felices análisis...

Buenos humos!